影響胚胎著床的胚胎因素

　　作者：周 怡，李婷婷，試管方 叢

　　單位：中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，嬰兒因素廣東 廣州

　　本文來源：實(shí)用婦產(chǎn)科雜志 2019 年 2 月第 35 卷第 2 期

　　胚胎著床是成功床胚胎經(jīng)過定位、黏附和侵入種植于子宮內(nèi)膜的率影過程，在人體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射—胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，響胚IVF/ICSI-ET)周期中胚胎著床率約 30%，胚胎反復(fù)著床失敗(recurrent implantation failure，認(rèn)識ＲIF)的試管發(fā)生率為12%～34%。胚胎因素、嬰兒因素子宮因素、成功床母體免疫異常等原因均可導(dǎo)致胚胎著床失敗。率影胚胎著床成功在臨床實(shí)踐中定義為出現(xiàn)超聲下可見妊娠囊。響胚目前ＲIF尚無統(tǒng)一定義，胚胎最近一篇系統(tǒng)回顧根據(jù)已有研究和專家意見建議定義為:連續(xù)兩次優(yōu)質(zhì)胚胎移植，認(rèn)識累計(jì)不少于4枚第3天胚胎和2枚囊胚，仍未獲得妊娠［1］。胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能是影響胚胎著床的決定性因素，胚胎染色體異常、透明帶硬化、體外培養(yǎng)環(huán)境不當(dāng)均會導(dǎo)致胚胎著床失敗。本文將全面闡述影響胚胎著床的胚胎因素及研究進(jìn)展，為從胚胎方面提高著床率提供新思路。

　　1、染色體異常

　　染色體異常是損害胚胎的發(fā)育能力、導(dǎo)致著床失敗的主要原因，自發(fā)性流產(chǎn)中胚胎非整倍體率高達(dá)70%［2］。配子異常和胚胎卵裂異常均可導(dǎo)致染色體異常。Kort等［3］回顧性分析了既往不良妊娠史( 包括復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、非整倍體妊娠、IVF 失敗) 和非醫(yī)學(xué)原因行性別鑒定IVF患者的植入前遺傳學(xué)篩查( preimplan- tation genetic screening，PGS) 結(jié)果，非整倍體數(shù)在有不良妊娠史患者中高，且非年齡依賴。

　　女性＞35歲后懷孕幾率和胚胎著床率明顯下降， 其主要原因是非整倍體卵子增加，胚胎染色體異常發(fā)生率高。Harton 等［2］的一項(xiàng)多中心回顧性分析中，不同年齡組 IVF / ICSI-ET 周期行微陣列比較基因組雜交( comparative genomic hybridization，CGH) ，篩選出整倍體胚胎移植。結(jié)果非整倍體率與年齡呈正相關(guān)，＜ 35歲發(fā)生率為 53. 1%，≥43 歲為 92. 6%。胚胎著床率在＜42 歲的患者中沒有隨年齡改變，≥43 歲的患者則下降。移植整倍體胚胎提高了高齡患者的著床率，這提示胚胎染色體非整倍體性是導(dǎo)致高齡女性著床失敗的重要原因。

　　染色體嵌合體是指在一個個體中同時存在兩種及以上染色體核型的細(xì)胞體系，在胚胎發(fā)育中很常 見，著床前胚胎發(fā)生率為 15% ～ 90%［4］。嵌合體會影響胚胎的發(fā)育和著床能力，影響程度與染色體異常發(fā)生的時間、數(shù)量、位置和后續(xù)發(fā)育等因素相關(guān)。在小鼠的嵌合體胚胎模型中發(fā)現(xiàn)嵌合體存在會導(dǎo)致不良結(jié)局，但隨著胚胎的發(fā)育，非整倍體細(xì)胞比例會減少，且有足夠數(shù)量正常細(xì)胞的嵌合體胚胎能發(fā)育為健康胚胎。這說明胚胎在發(fā)育過程中有一定的自我選擇和修復(fù)能力，嵌合體存在不一定會影響胚胎的最終結(jié)局，還需考慮嵌合體數(shù)量、發(fā)生的位置等。Spinella等［5］在一項(xiàng)前瞻性研究中為 77 例患者移植了嵌合體囊胚，根據(jù)嵌合體中非整倍體比例分為低比例嵌合體 (＜50%) 和高比例嵌合體( ＞ 50%) 。研究結(jié)果示低比例嵌合體較高比例嵌合體的胚胎種植率、臨床妊娠率 和活產(chǎn)率高( 分別為 48. 9% vs 24. 2%，40. 9% vs15. 2%，42. 2% vs 15. 2%) 。與移植整倍體囊胚患者比較，高比例嵌合體患者的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均降低( 分別為 24. 4% vs 54. 6%，15. 2% vs46. 4%，15. 2% vs 46. 6%) ，低嵌合體患者則無差異。

　　2 、透明帶因素

　　透明帶在阻止多精受精和維持胚胎完整性方面起重要作用，其異常會影響胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致著床失敗。暗色透明帶( dark zona pellucida，DZP ) 指在光鏡下折光率低、透光性差、顏色暗，DZP會導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、著床和臨床妊娠率下降。既往認(rèn)為透明帶厚度( zona pellucida thickness，ZPT) 及透明帶厚度變化 ( zona pellucida thickness variation，ZPTV) 會影響胚胎著床率，但 Lewis 等［6］對 768 例第 3 天新鮮移植胚胎的ZPTV 與胚胎著床之間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) ZPTV 與胚胎著床之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。胚胎孵出是著床過程中的重要環(huán)節(jié)，如透明帶硬化則不能孵出，導(dǎo)致著床失敗。輔助孵化( assisited hatching，AH) 包括機(jī)械法( 部分透明帶切除) 、化學(xué)法、激光法，近年來激光法被廣泛應(yīng)用于臨床，關(guān)于 AH 的作用一直存在爭議。有研究指出AH可以提高ＲIF患者的著床率和臨床妊娠率［7］。但在年齡＜38 歲且 ZPT≥13 μm 婦女中，AH 不能提高胚胎著床率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率［8］。最近的一項(xiàng)系統(tǒng)回顧認(rèn)為［9］，透明帶打薄 AH 對新鮮胚胎移植周期改善臨床結(jié)局作用有限，透明帶打孔 AH 可以提高凍融胚胎移植周期的著床率和臨床妊娠率。

　　3 、胚胎培養(yǎng)

　　良好的培養(yǎng)環(huán)境與技術(shù)是保證胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)，培養(yǎng)環(huán)境會直接影響早期胚胎的質(zhì)量，進(jìn)而影響胚胎的著床。培養(yǎng)液是與胚胎直接接觸的環(huán)境，也是胚胎體外發(fā)育唯一的營養(yǎng)來源，其組分、配比、pH值、滲透壓均與胚胎的質(zhì)量密切相關(guān)。現(xiàn)商品化的培養(yǎng)液主要包括序貫培養(yǎng)液和單一培養(yǎng)液。單一培養(yǎng)液有利于囊胚形成，提高囊胚質(zhì)量，但是對臨床結(jié)局兩者無差異［10］。有學(xué)者認(rèn)為胚胎在發(fā)育過程中可產(chǎn)生一些促進(jìn)發(fā)育的因子，將胚胎成組培養(yǎng)可以提高囊胚形成率和著床率。Ebner等［11］將 72 例患者 936 原核期胚胎隨機(jī)分為 3 組，分別為單獨(dú)培養(yǎng)、同一微滴單獨(dú)培養(yǎng)和成組培養(yǎng)( 每微滴 3 ～ 5 個) ，均培養(yǎng)至囊胚期。結(jié)果成組培養(yǎng)的胚胎有更高的囊胚形成率( 3 組分別為40. 8%、45. 2% 和 55. 8%) ，臨床妊娠率也提高。也有將卵裂期胚胎成組培養(yǎng)至第 3 天，與單獨(dú)培養(yǎng)胚胎相比著床率與妊娠率無差別，但在＜ 35 歲婦女中增加可用囊胚數(shù)［12］。目前各研究中所使用的培養(yǎng)方案不統(tǒng)一，尚需更多重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)其作用。

　　在傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系中，評估胚胎發(fā)育情況需將胚胎從培養(yǎng)箱中取出。多次、長時間的觀察會引起培養(yǎng)液溫度、pH值等參數(shù)改變，進(jìn)而對胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響。Time-lapse實(shí)時觀察系統(tǒng)無需移動胚胎就可進(jìn)行觀察評估，避免了對培養(yǎng)環(huán)境的干擾，可提高胚胎質(zhì)量和著床率。Barrie等［13］ 根據(jù)患者年齡、獲卵數(shù)、治療方案和取卵時間將使用Time-lapse 培養(yǎng)箱和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱的患者配對，通過分析比較得到兩組臨床妊娠率、著床率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 分別為 44. 8% vs 36. 5%，39. 3% vs 32. 2%) 。但近期的其他研究發(fā)現(xiàn)［14］，Time-lapse 培養(yǎng)體系沒有提高 IVF / ICSI 新鮮周期著床率。該研究未追蹤在試驗(yàn)中冷凍的胚胎結(jié)局，是否能獲得累計(jì)妊娠結(jié)局的提高還需進(jìn)一步探討。

　　4 、胚胎評估

　　篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎移植是提高 IVF / IC- SI-ET 成功率的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評估仍是目前最常用、最經(jīng)典的方法。胚胎的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)能反映胚胎質(zhì)量，可以較好預(yù)測胚胎發(fā)育潛能。卵裂期評估低質(zhì)量的胚胎發(fā)育為囊胚幾率降低，其發(fā)育而成的囊胚著床率也下降40%［15］。囊胚期胚胎評分可以反映其著床和繼續(xù)妊娠能力。Irani等［16］ 回顧性分析了417 例凍融整倍體囊胚移植周期，根據(jù)冷凍前評分將胚胎分為質(zhì)量極優(yōu)、優(yōu)質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)和差 4 組，發(fā)現(xiàn)極優(yōu)組和優(yōu)質(zhì)組的妊娠率顯著高于差組( 分別為 84. 2%、61. 8%和 35. 8%) ，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)( inner cell mass，ICM) 評分為 A的胚胎妊娠率高于 B 和 C ( 分別為 76. 2%、53. 6% 和13. 5%) 。滋養(yǎng)層細(xì)胞( trophectoderm，TE) 評分對預(yù)測胚胎發(fā)育潛能更重要。TE 評分為 A、B、C 時著床率分別為 67%、51%和 25%，活產(chǎn)率為 57%、40% 和 25%，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且ICM / TE 評分中 BA 著床率優(yōu)于AB 和BB( 分別為 80%和 52%、44%)［17］。

　　形態(tài)學(xué)評分不可避免帶有胚胎學(xué)家主觀因素，且沒有一個是胚胎質(zhì)量的絕對標(biāo)志，在評分為優(yōu)質(zhì)的胚胎中非整倍體并不少見。Time-lapse實(shí)時觀察系統(tǒng)可以動態(tài)連續(xù)觀察胚胎的發(fā)育情況，觀察到胚胎不正常分裂、碎片出現(xiàn)時間、囊胚形成時間等在傳統(tǒng)評估體系中無法獲得的信息，從而提供更多客觀準(zhǔn)確的形態(tài)動力學(xué)參數(shù)，利于全面評估胚胎的發(fā)育潛能，篩選出最優(yōu)的胚胎，提高著床率。目前其對胚胎的評估價(jià)值和臨床結(jié)局的改善仍有爭議。尋找能夠客觀預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的非侵入性指標(biāo)對篩選優(yōu)質(zhì)胚胎，提高著床率和臨床結(jié)局非常重要。

　　5 、胚胎移植選擇策略

　　胚胎移植是 IVF / ICSI-ET 過程中的最后一步，也是影響胚胎著床的關(guān)鍵因素。胚胎移植的時期、數(shù)目、移植技術(shù)、新鮮或者凍胚移植都會關(guān)系到著床成功率。在早期受體外培養(yǎng)技術(shù)的限制，多選擇 D2 / D3 胚胎移植。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷優(yōu)化，越來越多人選擇延長培養(yǎng)至 D5 / D6 囊胚移植。囊胚移植更符合人的生理狀態(tài)，且延長培養(yǎng)能夠淘汰發(fā)育差的胚胎，提高胚胎著床率。相關(guān)研究證實(shí)囊胚移植可以提高患者的著床率和妊娠率，但近期 Levi-Setti 等［18］ 在＜ 39 歲、至少獲 3 個受精卵和既往少于 4 次 IVF / ICSI-ET 周期史的患者中發(fā)現(xiàn)，新鮮周期中囊胚和卵裂期移植著床率和妊娠率無差異。囊胚移植會導(dǎo)致可移植和冷凍胚胎數(shù)減少，對于累計(jì)活產(chǎn)率的影響還需進(jìn)一步研究。

　　胚胎冷凍保存技術(shù)取得突破，使每取卵周期的成功率和胚胎利用率極大提高。在 ＲIF 患者中整倍體凍胚移植比鮮胚移植成功率高。移植數(shù)目增加能提高著床率，但多胎妊娠率增加了高危妊娠發(fā)生和孕產(chǎn)婦死亡的概率。我國已規(guī)定每個移植周期移植胚胎數(shù)不超過 3 個，35 歲以下婦女第 1 次助孕移植胚胎數(shù)不超過 2 個。

　　6、其他因素

　　線粒體是為細(xì)胞代謝提供能量的重要場所，當(dāng)胚胎發(fā)育異常時其能量代謝會發(fā)生改變，線粒體 DNA ( mitochondrial DNA，mtDNA ) 拷貝數(shù)會代償性增加。高齡女性、非整倍體和妊娠失敗的胚胎中有較多的mtDNA 拷貝數(shù)，且整倍體胚胎 mtDNA 拷貝數(shù)超過一定水平時不能著床［19］。mtDNA 拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量和種植潛能相關(guān)，測量 mtDNA 拷貝數(shù)可作為評估胚胎發(fā)育潛能的指標(biāo)。Victor 等［20］則在研究中指出，mtDNA拷貝數(shù)與胚胎整倍體性、年齡、著床能力不相關(guān)，其對胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測價(jià)值有待商榷。

　　此外，胚胎在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)與發(fā)育潛能和著床力相關(guān)，培養(yǎng)液中檢測胚胎基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP-9) 、白細(xì)胞介素 8( IL-8) 可用于預(yù)測著床率和妊娠率。緊縮現(xiàn)象指在囊胚形成期間，卵周間隙因滋養(yǎng)層細(xì)胞退縮再次出現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)［21］，緊縮現(xiàn)象的發(fā)生在非整倍體胚胎中高于整倍體，且會損害整倍體胚胎的著床能力。

　　7、結(jié) 語

　　輔助生殖技術(shù)的不斷進(jìn)步幫助眾多不孕不育夫婦實(shí)現(xiàn)了為人父母的愿望，但胚胎著床失敗仍是解決不孕癥的難題。現(xiàn)胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)日趨完善，冷凍技術(shù)提高了胚胎利用率，篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎移植是提高著床率的關(guān)鍵。植入前遺傳學(xué)檢測能夠篩選出染色體異常，Time-lapse實(shí)時監(jiān)測系統(tǒng)能夠提供胚胎發(fā)育過程中客觀的形態(tài)動力學(xué)指標(biāo)。如將兩者結(jié)合起來用于胚胎篩選，既能知道染色體是否正常，又能從形態(tài)學(xué)上更加客觀全面評估，利于篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎，提高著床率。因價(jià)格昂貴和缺乏足夠證據(jù)，目前沒有廣泛使用，其應(yīng)用是否利于妊娠結(jié)局還存在眾多爭議，需要進(jìn)一步探討。除此之外，多種動力學(xué)、代謝參數(shù)也被提出用于評價(jià)胚胎質(zhì)量，其預(yù)測價(jià)值仍尚需更多研究明確。提高胚胎質(zhì)量和尋找客觀無創(chuàng)的胚胎發(fā)育潛能預(yù)測指標(biāo)，是提高胚胎著床率仍需不斷探索的問題。

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